大块血管化组织工程骨修复的骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前在构建较大体积组织工程骨方面还存在比较多的问题，其中最主要的就是缺血坏死。血管化的构建是保证大块组织工程骨生物学功能的关键因素。
目的：制备大块血管化组织工程骨，行原位移植修复兔股骨干大面积缺损，探讨组织再生方式及特点。
方法：建立仿兔股骨干结构支架材料内血管化预构模型，基于预构血管化支架，再构建大块血管化组织工程骨。18只8周龄新西兰大白兔分成实验组和对照组，实验组用大块血管化组织工程骨进行体内原位移植；对照组体内原位移植大块组织工程骨，未进行血管化处理。造模后2，4，8周通过大体观察、X射线片以及组织切片观察比较2组大块骨缺损的修复情况。
结果与结论：大体观察及影像学观察结果均显示，造模后2，4，8周实验组的成骨情况均优于对照组。实验组兔造模后2，4，8周的新生骨组织占总移植骨面积比均显著高于对照组(P < 0.01)。提示修复大面积的骨缺损，采用大块血管化组织工程骨比单纯采用组织工程骨的效果更好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 血管内皮细胞, 大块组织工程骨, 血管化, 预血管化支架, 骨髓间充质干细胞, 成骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: Currently, there are many problems existing in the construction of large tissue-engineered bone, and the most important is ischemic necrosis. Vascularization is critical for the biological function of large tissue-engineered bone.
OBJECTIVE: To prepare large pieces of vascularized tissue-engineered bone for orthotopic transplantation in repairing large femoral defects of rabbits, and to explore tissue regeneration methods and characteristics.
METHODS: Rabbit femoral structure was firstly imitated to construct a vascularized prefabricated model, based on which, we constructed large pieces of vascularized tissue-engineered bone. A total of 18 New Zealand white rabbit 18, aged 8 weeks, were divided into experimental group and control group. The experimental group was subject to orthotopic transplantation of large vascularized tissue-engineered bone, while the control group was treated with orthotopic transplantation of large tissue-engineered bone without vascularization processing. After 2, 4, 8 weeks, gross observation, X-ray films, and tissue section were compared between the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Gross observation and imaging observation showed that the osteogenesis in the experimental group at 2, 4, 8 weeks were better than that in the control group. The ratio of new bone tissue to total area of bone graft was significantly higher in the experimental group than the control group at 2, 4, 8 weeks postoperatively (P < 0.01). These findings indicate that large vascularized tissue-engineered bone is preferred to the repair of large bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: tissue engineering, osteonecrosis, mesenchymal stem cells, osteoblasts, neovascularization, physiologic

中图分类号:

R318

李耀华. 大块血管化组织工程骨修复的骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 991-996.

Li Yao-hua. Large vascularized tissue-engineered bone for repair of bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(7): 991-996.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 造模未造成动物死亡，进入结果分析最终为18只兔，无脱失，实验组和对照组各9只。

2.2 大体观察 造模后2周时，实验组新生组织软骨层内充满不成熟软骨样组织，胶原纤维杂乱排列，可以观察到明显的纤维结缔组织连接；对照组仅有少量骨痂形成。

造模后4周，实验组有大量连续性骨痂形成，并有血管长入支架内，且血管周围形成编织骨；对照组仅有骨痂形成较前有所增多。

造模后8周，实验组大块血管化组织工程骨直径和厚度基本和宿主骨相同，其中有2只比宿主骨还要厚；对照组有大骨痂形成，但是仍然骨不连。

2.3 影像学检查 造模后2周时，实验组X射线摄片大块血管化组织工程骨处可见大片云雾状密度增高影；对照组仅显支架上下端有少许云雾状密度增高影。

造模后4周，实验组有X射线摄片可见大块血管化组织工程骨周围有片状阻射影，骨连接处界线模糊；对照组云雾状密度增高影有所增多，但是骨连接处界线清晰。

造模后8周，实验组X射线摄片可见大块血管化组织工程骨显骨性连续性连接，为连续性高密度影；对照组有大片状密度增高影，骨连接处界线仍然模糊可见。

2.4 组织学检查 造模后2周时，实验组可见大量毛细血管增生周边可见新生骨小梁，大块血管化组织工程骨周围有丰富的纤维组织；对照毛细血管少，且较短小未能长入支架中，新生骨小梁也明显少于实验组，支架周围纤维组织也少。

造模后4周，实验组工程骨周围血管丰富，基本布满整个工程骨，纤维组织下有大量新生骨组织，并可见大量活跃的成骨细胞；对照毛细血管较前增多，周围有少量新骨形成。

造模后8周，实验组的大块血管化组织工程骨已经和宿主骨被骨组织桥接，并逐渐形成板成骨内有髓腔样结构；对照组也有较多成骨细胞核新生骨，但是和实验组比较差别明显。

2.5 新生骨组织占总移植骨的面积比 通过对比造模后2，4，8周新生骨组织占总移植骨面积比，2组之间差异有显著性意义(P < 0.01，表1)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年6月至2012年12月在河北北方学院医学院干细胞实验室完成。

材料：

实验动物：健康8周龄新西兰大白兔18只，体质量1.7-2.3(2.0±0.3) kg，雌雄各半，按随机数字表法分成实验组和对照组，每组各9只，由南方医科大学实验动物中心提供，并在标准的实验条件下圈养。实验得到了南方医科大学伦理委员会等监督管理部门的批准，证书编号：SCXK粤2011-0026，所有操作都按照指导方针实施。

实验方法：

兔骨髓间充质干细胞的获取：按骨髓培养法进行，动物麻醉后，取兔髂骨处红骨髓4.0-5.0 mL，500 U/mL肝素溶液抗凝，加入D-Hank’s液混匀后1 000 r/min离心10 min弃上清和脂肪层，沉淀用D-Hank’s液重新打匀，然后将 0.17 mmol/L NH₄Cl溶液按1∶5的体积比加入，4 ℃保留10 min，取出再离心(1 000 r/min×10 min)，弃上清液，以D-Hank’s液重新打匀离心(1 000 r/min×5 min)，取下层有核细胞，加入含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM完全培养基，计数后接种于 25 cm²培养瓶在37 ℃体积分数5%CO₂及饱和湿度条件下培养，传代培养。

兔血管内皮细胞的获取：骨髓间充质干细胞融合70%时，以PBS漂洗两三次，以内皮细胞诱导培养液培养，二至三天换液1次，诱导分化21 d后，通过形态学观察（图1A)，Ⅷ因子相关抗原的免疫组化法，透射电镜观察鉴定其细胞的性质。

兔成骨细胞的获取：骨髓间充质干细胞融合70%时，以PBS漂洗两三次，以成骨诱导培养液培养，二至三天换液1次，诱导分化28 d，通过形态学观察，测定碱性磷酸酶活性，Von Kossa染色法观察钙化结节，Ⅰ型胶原染色鉴定细胞性质，以备后期组织工程骨构建使用(图1B)。

荧光蛋白标记种子细胞：按前述方法获取和培养骨髓间充质干细胞，至细胞融合达50%时，去除培养基，用无血清培养基洗涤后，用携带有荧光蛋白-慢病毒复合体的上清感染，维持液中含感染复数(MOI)为50的荧光蛋白-慢病毒10¹¹ L^-¹，12 h后更换含体积分数10%胎牛血清的正常培养液继续培养。转染后三四天用荧光相差显微镜观察，以未转染的同期细胞作为背景荧光，随机计数多个低倍视野中成功转换荧光蛋白的细胞数量，计算荧光的转染效率。 5 d后使用流式细胞仪评价转染后细胞活力并分选荧光蛋白表达阳性的细胞备用。最终获得转染绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞和转染红色荧光蛋白的血管内皮细胞(图2A，B)；获得转染绿色荧光蛋白的成骨细胞(图2C)。

仿兔股骨干结构支架材料内血管化预构模型的建立：轴向血管束的分离制备，动物麻醉后，在一侧后肢内侧做一纵形切口，长约5 cm，切开皮肤、皮下组织和深筋膜，暴露和游离足够长度的股部轴向动静脉血管束。将液态Ⅰ型鼠尾胶原(1.5 g/L)和液态人血浆纤维连接蛋白(90 g/L)，储存在4 ℃冰箱内。制备支架时以1∶1比例在4 ℃条件下将二者混匀，将1×10⁶血管化种子细胞悬液与液态胶原/纤连蛋白充分混合，其中骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞的接种浓度比为1∶4，用2 mol/L NaOH调整pH值至7.4。在37 ℃条件下使胶原/纤连蛋白充分聚合并包绕血管束，最后获得预血管化支架。用硅胶袋包裹支架材料并植回兔股部孵化。

大块血管化组织工程骨的制备：采用在圆柱状β-TCP材料的基础上，设计和构建了一种模拟兔股骨干结构的新型支架材料，材料长度为15 mm，直径为12 mm。该材料具有中空管状结构，由管壁和管腔组成，管壁上有一侧槽，在矢状位与管腔相通。

管壁结构由β-TCP构成，其内有大量相通的孔隙结构，并且这些孔隙结构与材料外表面和材料中央的管腔均相通，这些结构不但可为后期种子细胞的植入提供空间，也有利于血管网的长入。在预构血管化支架时，可利用胶原/纤连蛋白凝胶独特的理化性质，即在4 ℃条件下为液态，当其酸性可溶成分被中和后，37 ℃条件下可根据需要聚合成各种形状的固态凝胶支架。这样可以先将轴向动静脉血管束游离植入材料中央的管腔结构内，然后在 4 ℃条件下将搭载有成血管化种子细胞的液态胶原/纤连蛋白凝胶通过材料的侧槽均匀浸入并包埋在轴向血管束周围。最后通过调控温度，在37 ℃条件下促使胶原/纤连蛋白充分聚合，由液态向固态转变，这样聚合后的凝胶既可紧密的包绕轴向血管束的周围，又能与管壁的β-TCP结构充分结合，从而完成兔大块血管化组织工程骨的构建。

用同样方法制备其他8块大块血管化组织工程骨，并且植回实验组新西兰大白兔；对照组9只兔仅按上述方法制备大块组织工程骨，未进行血管化处理，也用同样方法植回新西兰大白兔。

主要观察指标：在造模回植后的第2，4，8周3个时间点取出实验组的大块血管化组织工程骨和对照组的大块工程骨进行观察，每次每组各处死3只，观察大体标本的新骨的形成情况，并就影像学及组织学检查结果进行对比。

通过组织学对造模回植后2，4，8周切取的大块血管化组织工程骨进行切片、冰冻切片、免疫组化染色、荧光倒置显微镜观察，观察材料内新生血管网的形成情况(图2D)。

利用RT-PCR和Western blot检测组织工程骨中CD31、血管性血友病因子、肌钙蛋白、肌球蛋白的表达，其中CD31、血管性血友病因子为血管内皮细胞的主要表面标志物，肌钙蛋白、肌球蛋白为构成血管外周细胞的主要标志物，用以评价种子细胞向血管分化的能力和材料内血管形成情况(图3)。

通过影像学检查对比2组新骨的生长情况。其中有一张是术后8周通过Micro-CT对2组移植骨进行重建图(图4)。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 16.0统计软件对各变量进行正态性检验和描述性分析。计量资料数据以x(_)±s表示，计数资料以绝对值或者构成比表示，如果计量资料呈正态分布且方差齐采用t 检验，如果计量资料不符合正态性分布则用秩和检验，计数比较则采用χ²检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

骨组织工程技术为骨缺损修复开辟了一条新的道路，但如何保证植入材料内种子细胞的存活是目前的难点^[8-10]。近年研究证实，及时充分的血液供应是解决这一问题的关键，也是构建大块组织工程骨的前提。正常骨组织中含有丰富的血管网，其与骨之间形成紧密的空间构型，这种构型关系是维持骨完整性的关键^[11-12]。血管在骨骼的发生与修复过程中所起的作用不言而喻^[13]。在骨损伤修复过程中，血运的恢复主要有两种方式，一种为血管形成(vasculogenesis)，是由原始的胚胎期细胞分化为血管的过程；另一种为血管生成(angiogenesis)，即在已存在的血管中出芽或套叠生长出血管。两种方式均通过血管内皮细胞的迁移、黏附，形成管样组织，进而促进血管外周细胞等支持细胞附着于管样组织周围，最终共同围成新生血管^[14]。此后，血液中的间充质干细胞、通过新生血管网进入损伤区，分化为特定的细胞，分泌生长因子促进骨修复^[15]。由此可见，血液供应的重建是骨修复和再生的前提^[16-17]。

鉴于血运对骨修复和再生的重要作用，所以这次实验重点探讨如何给大块工程骨提供充分的血液供应。先构建血管化组织工程骨支架，保证其充分血管化，从而促进后期移植种子细胞的存活及成骨分化，这次实验作者采用兔作为实验动物，利用预先设计的模拟兔股骨干结构的支架材料进行血管化预构。该支架材料具备中空管道样结构，管道壁由具备多孔结构的β-TCP构成，孔隙结构向外可与材料外表面相通，向内可与材料中央的管腔结构相通^[18-20]。首先分离获得兔股部轴向动静脉血管束并植入材料的管腔中央，将复合有血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞的胶原/纤连蛋白凝胶浸入材料的管腔内并包裹在植入的轴向血管束周围，控制温度使凝胶聚合并填充管腔，使血管束和支架材料形成一整体^[21]。希望通过血管化种子细胞与轴向血管束的共同作用，加快支架材料内预血管化的构建速度^[22-23]。支架材料外周用硅胶袋包裹防止周围组织长入管壁，影响后期成骨化种子细胞植入，将支架回植体内。观察不同时间点支架材料中新生血管的分布范围和密度。然后通过负压抽吸和反复灌洗法将成骨细胞植入预血管化支架的管壁β-TCP结构内，然后将材料细胞复合体植入兔股部肌腹中，在内环境的作用下进一步促进管壁的血管化和成骨。最后，制备兔股骨干骨缺损模型，将大块血管化组织工程骨移植到股骨干骨缺损区域。

一般组织工程骨移植入体内后主要的血液供应有两个来源^[24-25]，一是新生的血管长入，二是局部的血液浸润渗透。新生的血管长入作用持久而广泛，但是新生的血管长入并且分布大块工程骨需要较长的时间，往往就在这段时间(一般认为需要2周以上的时间)大块工程骨就会出现缺血坏死被吸收；血液浸润渗透虽然能在短时间内为植入物内部的种子细胞提供适宜生长的微环境，但是其作用范围有限，只有在血液浸润的200 μm范围内的组织才能获得有效的氧供与营养物质^[26-28]。传统组织工程骨的构建方法是将支架材料与种子细胞混合培养后，直接移植到体内继续构建，由于材料内无法预先构建出新生血管网，仅依赖宿主血管的长入或局部血液浸润，不仅空间范围有限，且时间也难以匹配，根本无法使材料内的种子细胞获得及时的营养而发生大量坏死。仅有少数支架周边的细胞能依靠内环境的作用来获得营养而维持存活^[29-30]。这不难解释，为何期望通过增加种子细胞数量或增加支架材料的体积，仍无法构建出大块组织工程骨^[31-33]。因此，如何在组织工程骨构建的同时重建其血液供应是构建具有生物活性组织工程骨的关键，也是目前制约组织工程骨从基础研究向临床应用过渡的关键性问题^[34-35]。

作者通过改变传统血管化组织工程骨的构建思路，探索新方法的可行性，即在成骨化种子细胞移植之前就通过血管化种子细胞联合血管束植入预构充分血管化的支架材料，然后再将成骨化种子细胞种植到支架材料中，这样种子细胞就能迅速地获得邻近血管网的支持，从而获得及时充分的营养以支持其存活及后续分化^[36-37]。

综上所述，采用血管化种子细胞联合胶原/纤连蛋白凝胶构建的血管网，同时将构建的血管网与宿主血管吻合；再经过一定时间的体内孵化是可以实现大块组织工程骨内的血管网的构建^[38-40]。因此，这次实验为大块组织工程骨修复骨的体内存活问题提供了一条新的解决途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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